Агробактериальная трансформация ячменя
Агробактериальный способ доставки ДНК имеет явные преимущества перед другими самыми распространенными методами трансформации растений (баллистическим, електропорации, микроинъекции). Этот метод позволяет вводить в реципиент сравнительно большую генетическую конструкцию, приводит к минимальным нарушениям в кодирующей последовательности гена, который переносится, обеспечивает включение в геном реципиента ограничено число копий инородного гена, и наконец, не требует применения специального оборудования.
Агробактериальний механизм переноса генов применяют главным образом к двудольным растениям. Использование агробактерии для трансформации однодольных растений до недавнего времени было ограничено. Существует естественный барьер, который препятствует взаимодействию агробактерии и однодольных растений. Предусматривается, что это связано с тем, что однодольные растения, в противовес двудольным, или не выделяют совсем, или выделяют из тканей раненых слишком мало специфических феноловых соединений типа ацетосирингона [1]. Известно, что эти соединения активируют гены вирулентности (vіr-гены) Ти-плазмиди агробактерии. Было выражено предположение о возможностях повышения эффективности агробактериальной трансформации за счет добавления ацетосирингона в смесь для общего культивирования препарата растительных тканей и суспензии агробактерии. Таким способом удалось осуществить агробактериальну трансформацию ряда злаковых культур.
Цель данной работы - оптимизировать и по возможности упростить метод агробактериальной трансформации однодольных растений на примере ячменя.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
За основу генетической агробактериальной трансформации ячменя была взята методика общего культивирования растительных тканей (експлантив) и агробактерии [7]
Реципиентна система. Как реципиенты использовали семена ячменя (Hordeum vulgare L.) сорт Scarlett, предоставленные Инновационным центром селекции и производства пивоваренного ячменя «Хордес» при Министерстве сельского хозяйства РФ.
Бактериальный материал. Для трансформации использовали штамм Agrobacterium tuimfaciens 3850/рВАЗ, любезно предоставленный профессором Б. А. Левенко (Институт физиологии растений и генетики НАН Украины). Плазмида рваз содержит bar-ген (bialaphos resistance), который определяет стойкость к фосфинотрицину, активному действующему началу гербицида биалафос (коммерческое название гербицида — "Basta").
Процедура трансформации.Агробактерії на протяжении суток культивировали в жидкой среде LB с добавлением 50 мг/л канамицину и 50 мг/л рифампицину. Культивирования проводили на скалке (150—200 об/хв) в темноте при температуре 28°.
Экстракт из растений табака получали из вирослих в стерильных условиях растений таким способом: лисття мелко нарезали, помещали в колбу (50 мл) с жидкой средой МС без гормонов и проводили инкубацию на протяжении 2 год на скалке с круговым вращением.
Раствор ацетосирингону стерилизовали фильтрованием через фильтры Millipor (размер пop 0,2 мкм).
Семена ячменя стерилизовали в хлормисному растворе («Белье», Россия) на протяжении 10 хв, что стерилизующий раствор удаляли и семена тщательным образом промывали стерильной дистиллированной водой (не менее 3 раз) на протяжении 30 хв. После
стерилизации, зерна разрезали поясницу скальпелем.
Непосредственно перед проведением трансформации бактериальную суспензию и экстракт из растений табака смешивали в ровных соотношениях.
Части зерен, которые содержат зародышей, помещали в агробактериальну суспензию с добавлением экстракту из растений табака или ацетосирингону (50 мкм) и выдерживали в условиях вакуума кГс/див2) 1—2 год. Этот прием используется для заполнения бактериальной суспензией межклеточного пространства препарата зерен.
Общее культивирование агробактерий и насинь проводили на скалке (200 об/хв) на протяжении 1—2 суток в темноте при температуре 28°.
После инокуляции семян переносили на стерильную фильтровальную бумагу или ткань для удаления суспензии агробактерий. Потом на протяжении 7—10 дней их проращивали в световой камере на среде МС (1/2 концентрации минеральных солей, без гормонов) с добавлением 500 мг/л клафорану (Roussel Uclaf, Франция) для ингибування последующего роста агробактерий и 50 мг/л канамицина («Ферейн», Россия) как селективный агент. Культивирования растительного материала проводили в следующих условиях: 24—25°; освещенность 5 клк; длительность светового дня 16 год.
Зеленые проростки ячменя взрывали в ґрунт и выращивали в теплице при температуре 20° и длительности светового дня 14 ч.
Через 10-15 дней растения опрыскивали раствором гербицида "Basta" (8 мг/л). Растения, стойкие к гербициду, имели зеленую расцветку и продолжали формировать вегетативные органы.
РЕЗУЛЬТАТЫ и ОБСУЖДЕНИЯ
За последние годы были выполнены ряд работ из трансформации ячменя, в том числе и агробактериальним методом. В большинстве случаев как реципиенты были использованы незрелые зародыши сорта Golden Promise или полученный из них морфогенний каллус. Впоследствии для получения трансформируемых растений необходимо было регенерировать растения из каллуса, что неминуемо связано с длительным
культивированием in vitro, использованием фитогормонив и риском проявления сомаклональной изменчивости.
Долгое время считалось, что на процесс трансформации существенное влияние делает повреждение потенциального хозяина. Все попытки провести трансформацию однодольных растений через невредимый эпидермис долгое время оставались безуспешными. В 1987 г. была проведена успешная агробактериальна трансформация насинь, что прорастают, Arabidopsis thaliana.
Длительность сокультивування агробактерий и насинь. За результатами наших предыдущих опытов и за литературным данными, оптимальное время трансформации составляет не менее сутки [14]. Возможно, именно такое время необходимо для проникновения агробактерий сквозь клеточную стенку однодольных растений, если этот процесс происходит путем ферментативного растворения клеточной стенки [15]. При меньшем времени экспозиции появление трансформируемых растений в наших опытах не наблюдалось. Сокультивування на протяжении больше 2 суток приводит к резкому увеличению концентрации бактериальных клеток в суспензии и их гиблом влиянии на семена. Да, если после 24 ч инкубации насинь в суспензии агробактерий всходят 70 % насинь ячменя, то через 2 суток-55 %, а через 3 диб- 15 % (усреднены показатели, полученные в данной работе).
Использования как факторов, которые стимулируют трансформацию, ацетосирингону и экстракту из растений табака. Некоторые культуры для проведения успешной трансформации, требуют особенных условий сокультивування. Так например, для повышения эффективности трансформации сахарного камыша в суспензию, которая содержит A. tutnefaciens и експланти, добавляли аскорбиновую кислоту (0,09 мкм) и цистеин (0,33 мкм) [16]. Для успешной агробактериальной трансформации однодольных растений обычно используют ацетосирингон [17-19].
Экстракт из растений табака на практике широко и с успехом применяют при проведении агробактериальной трансформации самый разных видов растений и експлантив. Известно, что механически поврежденные и растительные клетки, которые активно делятся, двудольных растений образуют вещества, индуктирующие vіr-гены [20]. Вполне возможно, что
экстракт табака является естественным источником подобных веществ.
При обработке насинь ячменя суспензией A. tumefaciens, что содержит ацетосирингон или экстракт табака, нами получены стойкие к канамицину растения. Зелени регенеранти взрывали в ґрунт. Через 10—15 дней культивирования растения обрабатывали гербицидом "Basta" в концентрации 8 мг/л. Растения, стойкие к гербициду, имели зеленую расцветку и формировали вегетативные органы. В части из них Пцр-анализ подтвердил включение в ДНК растений гена bar (рисунок).
Без использования ацетосирингону или табачного экстракта получить трансформируемые растения не удалось (контрольный вариант). Для осуществления трансформации оказалась эффективной искусственная активация генов вирулентности бактерий.
Хотя ацетосирингон и ингибуе в некоторой степени прорастание насинь ячменя, однако частота трансформации растений ячменя в результате данного эксперимента составляет 2%. Этот показатель для однодольных растений отвечает среднему уровню и потому является вполне приемлемым. Следует отметить, что при использовании экстракта табака (без ацетосирингону) частота трансформации немного выше (2,7%).
Применение вакуумной обработки. Применение вакуумной обработки впервые было осуществлено при трансформации Arabidopsis thaliana [21 ]. Этот способ активно используется для получения трансформируемых растений однодольных других видов [14, 22]. Для повышения эффективности трансформации семян выдерживали в агробактериальной суспензии (с добавлением экстракту табака) в условиях вакуума (-1 кГс/див ) на протяжении 1 год. Цель такой обработки заключалась в облегчении проникновения клеток агробактерий во внутренние ткани зерновки.
Применение вакуумной инфильтрации дало позитивный эффект. Хотя обработка вакуумом немного гнетет прорастание насинь, однако частота трансформируемых растений достигла 4 %. Для однодольных культур это хороший результат.